重组酵母GS115/PSD、GS115/CEC的构建及其对水果采

2020-01-25  阅读次数:

  由真菌病原菌惹起的果实采后病害对人们形成了严重的经济损掉。用拮抗酵母代替化学杀菌剂,或降低化学杀菌剂的应用量(即生物防治BCPD),具有优胜的应用远景,然则通俗拮抗菌很难到达化学杀菌剂的杀菌后果,因此遴选新型拮抗菌或提高原有拮抗菌拮抗效能成了该范围的研究热门。经过基因工程技巧改革拮抗酵母从而提高其生防后果是果蔬采后病害生物防治的新方法。本文评论辩论了将抗菌肽基因转移到酵母中表达以提高其生防后果的方法,胜利的将外源抗菌肽基因CecropinA和PsdI在毕赤酵母中停止表达并对重组酵母GS115/CEC、GS115/PSD的平安性及对果蔬采后的主要致病菌和果蔬真菌病原菌惹起的腐败的抑制后果停止了研究:评论辩论了该酵母与外源物质联合应用对果蔬采后病害抑制后果的影响;初步研究了该酵母对果蔬致病菌的抑制机理及对果蔬储藏后质量的影响,其主要研究结果以下:

  (1)依据已报导基因序列分化抗菌肽Cecropin A和PsdI基因片段,并将其连接到PGEM-T载体上。在此基础大将目标基因拔出酵母表达载体pPIC9K,构建毕赤酵母表达载体。将其线性化后,用电转化法导入Pichia Pastoris GS115中。采取G418停止梯度遴选高抗性转化子。以甲醇作为引诱物,取发酵培养3d后的发酵上清液,停止Tricine-SDS-PAGE验证了基因表达的准确性。而且经接种培养、引引发酵及PCR判定等验证了重组酵母具有优胜的动摇性。

  (2)经过对重组毕赤酵母GS115/CEC、GS115/PSD发酵过程的两个阶段发酵条件的优化试验,得出身长阶段优化后的发酵工艺为:甘油2%,硫酸铵2%,pH=6.5-7.5,30℃条件下培养72h。外源基因引诱表达阶段优化后的发酵工艺为:甲醇1%,硫酸铵2%,pH=7.0,30℃条件下培养72h。采取正交试验来优化毕赤酵母的发酵条件,其影响发酵的主要要素及影响的大年夜小依次为:温度>甲醇浓度>发酵天数>溶液pH值。终究掉掉落重组毕赤酵母发酵过程当中各项影响要素的优化值,即pH5.5,甲醇浓度为1%,温度为30℃,时间为4d,在优化后的发酵条件下,重组酵母GS115/CEC、GS115/PSD表达的外源蛋白含量平都可达15.1及11.3 mg/L。

  (3)应用重组酵母对4种果实的4种主要采后致病菌停止了体外及体内生防试验:平板抑菌试验及液体抑菌试验均标明重组酵母在体外对病原菌有广谱抑菌活性;试验标明该重组酵母可清晰抑制链格孢、灰葡萄孢在番茄果实上的侵染;抑制扩大青霉惹起的苹果及梨的腐败;抑制灰葡萄孢惹起的梨和苹果腐败。同时试验标明,重组酵母对病原真菌的抑制效能与其细胞悬浮液的浓度有关,浓度越高,对致病菌的抑制造用也越强。

  (4)对重组酵母抑菌机理的研究结果标明,抑菌机制除表现了传统的营养与空间的竞争外,采取扫描电镜、透射电镜不美观察发明表达抗菌肽基因的重组酵母处理的真菌外部形状和外部结构都爆发了很大年夜的变更,出现了畸形,决裂,断残等现象。证清晰明了其对真菌的膜结构及细胞外部结构的破坏感化。